Next-Generation Sequencing (NGS)

In den letzten Jahren wurden neue Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung entwickelt, die unter dem Begriff Next-Generation Sequencing (NGS), zusammengefasst werden.

Sie beruhen auf der Idee der massiven parallelen Sequenzierung von Millionen DNA-Fragmenten in einem einzigen Sequenzierlauf. Zunächst in der Forschung insbesondere für die Identifizierung neuer Krankheitsgene eingesetzt, hat die Anwendung von NGS mittlerweile das gesamte Feld der Molekularpathologie revolutioniert: So ist es nun im molekularbiologisch, diagnostischen Bereich möglich, praktisch alle monogenen Krankheitsbilder, insbesondere auch solche mit ausgeprägter genetischer Heterogenität, umfassend zu analysieren.

Bei uns kommen unterschiedliche Gen-Panels für eine personalisierte, hochspezifische Tumoranalytik zum Einsatz. Bei der Zusammenstellung der Gen-Panels werden alle Gene, deren Mutationen nach aktueller Literaturlage / Biodatenbanken mit dem entsprechenden Phänotyp assoziiert sind, berücksichtigt. Dies bedeutet, dass auch mögliche Differenzialdiagnosen simultan beurteilt oder abgeklärt werden können. Wir sequenzieren hier mit Hilfe unterschiedlicher Sequenziertechnologien bzw. Gerätesysteme die entsprechenden Genabschnitte (Exone und angrenzende intronische Sequenzen), nachdem diese aus der gesamtgenomischen DNA angereichert wurden (sequence capture). Die NGS-Biodaten werden kontinuierlich durch ein Team von Naturwissenschaftlern weiterentwickelt und in eine bioinformatische Pipeline prozessiert. Die erzielte Sequenziertiefe ermöglicht zudem die Detektion struktureller Varianten wie Deletionen und Duplikationen, sogenannter CNVs (copy number variations), die der konventionellen Sequenzierung entgehen. Mittels NGS nachgewiesene pathogene Veränderungen werden mit konventioneller Sanger-Sequenzierung / Pyrosequenzierung bzw. Microarrays oder RT-qPCR (bei CNVs) validiert. Der an den einsendenden Arzt übermittelte Befund enthält eine ausführliche Interpretation der identifizierten Varianten durch ein erfahrenes Team von biomedizinischen Experten / Naturwissenschaftler und Fachärzten für Pathologie.

Die NGS-Analytik löst zunehmend die klassische Stufendiagnostik für heterogene Erkrankungen („Gen für Gen“-Analyse) mittels Sanger-Sequenzierung ab, da sie folgende Vorteile bietet:

Erläuterungen:

 

Amplikon

Der Begriff Amplikon bezeichnet ein durch eine Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigtes DNA-Fragment definierter Länge.

 

Tumormutationslast

Als Tumormutationslast (tumor mutational burden, TMB) ist die Anzahl somatischer, tumor-spezifischer Mutationen in einem genetischen, exonischen Territorium von 1 Mb definiert.

 

Mikrosatelliteninstabilität

Als Mikrosatelliten bezeichnet man kurze DNA-Abschnitte mit einfachen Wiederholungsmustern. Während der Zellteilung auftretende Fehler innerhalb dieser Abschnitte werden normalerweise vom Reparatursystem korrigiert. Läuft diese Korrektur nicht intakt ab, so entstehen Mikrosatelliten unterschiedlicher Längen und man spricht von Mikrosatelliteninstabilität (MSI).

 

Intronisch

Als intronisch werden die nicht kodierenden Bereiche der DNA innerhalb eines Gens bezeichnet, die exonische Bereiche (kodierende Abschnitte), voneinander trennen.

 

Sequencing by Synthesis

Dieser Begriff bezeichnet eine Sequenziertechnik, bei der in jedem Sequenzierzyklus genau ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid komplementär zur Template-DNA eingebaut wird, das in Echtzeit detektiert wird.

 

Liquid biopsy

Eine liquid biopsy (Flüssigbiopsie) bezeichnet eine gesondert fixierte Blutprobe zum Nachweis zellfreier, zirkulierender Tumor-DNA.

 

Exon

Abschnitt eines Gens, der die nötige Information für die Erzeugung von Proteinen enthält